样品制备方法

一．细胞培养上清液

移取细胞培养基至离心管中，4℃ 下以 1500 rpm 的速度离心 10 分钟。

立即分装上清液，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

二．细胞提取物

将组织培养板置于冰上。

吸取培养基，并小心地用冰冷的 PBS 清洗细胞一次。

吸取 PBS，每 100 mm 孔板加入 0.5 mL 完全提取缓冲液。

刮取细胞收集在倾斜的孔板中，并移至预冷的试管内。

短暂涡旋，冰上孵育 15-30 分钟。

4℃ 下以 13,000 rpm 的速度离心 10 分钟，沉淀不溶性内容物。

将上清液(即可溶性细胞提取物)等分，置于冰上清洁冷冻管，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

三．条件培养液

将细胞置于完全(含血清)生长培养基中，使细胞增殖至所需的融合水平。

去除生长培养基，并非常小心地用几毫升温 PBS 清洗。重复清洗步骤。

去除最后一次 PBS 洗液，小心地加入无血清生长培养基。

孵育 1-2 天。

移取培养基至离心管中，4℃ 下以 1500 rpm 的速度离心 10 分钟。

立即分装上清液，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

四．血 清

将全血收集在未处理的试管中，或例如，不含抗凝剂的试管中，如 BD Vacutainer 血清试管。

室温下不受干扰地孵育 20 分钟。

4℃ 下以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟。

立即分装上清液(血清)，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

五．血 浆

将全血收集到含抗凝剂的试管中，例如 BD Vacutainer 电凝管(目录号：363080/363080)或加入 0.1 M 柠檬酸钠至 1/10 最终体积。

4℃ 下以 3000 rpm 的速度离心 10 分钟。

立即分装上清液(血浆)，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

六．尿 液

采集样品，4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。

分装上清液，并将样品储存在 -80℃ 下。尽量减少冻融循环。

七．组织提取物

使用干净的工具解剖目标组织，最好尽快置于冰上，以防被蛋白酶降解。

将组织置于圆底微量离心管中，浸入液氮中“速冻”。在 -80℃ 下存储样品备用，或将样品置于冰上立即匀浆。

对于约 5 mg 组织块，向试管中加入约 300 μL 完全提取缓冲液(参见细胞/组织提取缓冲液配方)，并用电动匀浆器匀浆。

每次使用 300 μL 完全提取缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4℃ 下持续搅拌 2 小时(例如，置于冷藏室的轨道振荡器上)。

在 4℃ 下以 13,000 rpm 的速度离心 20 分钟。置于冰上，将上清液(即为可溶性蛋白提取物)等分至新鲜、冷冻的试管中，并在 -80℃ 下存储样品。尽量减少冻融循环。

八．细胞/组织提取缓冲液配方

细胞/组织提取缓冲液配方

150 mM 氯化钠

1 mM EGTA

1 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% 脱氧胆酸钠

生产完全提取缓冲液所需的额外试剂。

磷酸酶抑制剂混合物

蛋白酶抑制剂混合物

PMSF

以上，实验前，需按照生产商所述，向细胞提取缓冲液中添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物，并添加 PMSF 至 1 mM。必须根据存在的组织量确定裂解缓冲液的体积。最终蛋白提取物的典型浓度 > 1 mg/mL！